影響胚胎著床的胚胎因素

　　作者：周 怡，李婷婷，試管方 叢

　　單位：中山大學附屬第六醫院生殖醫學研究中心，嬰兒因素廣東 廣州

　　本文來源：實用婦產科雜志 2019 年 2 月第 35 卷第 2 期

　　胚胎著床是成功床胚胎經過定位、黏附和侵入種植于子宮內膜的率影過程，在人體外受精/卵胞漿內單精子注射—胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，響胚IVF/ICSI-ET)周期中胚胎著床率約 30%，胚胎反復著床失敗(recurrent implantation failure，認識ＲIF)的試管發生率為12%～34%。胚胎因素、嬰兒因素子宮因素、成功床母體免疫異常等原因均可導致胚胎著床失敗。率影胚胎著床成功在臨床實踐中定義為出現超聲下可見妊娠囊。響胚目前ＲIF尚無統一定義，胚胎最近一篇系統回顧根據已有研究和專家意見建議定義為:連續兩次優質胚胎移植，認識累計不少于4枚第3天胚胎和2枚囊胚，仍未獲得妊娠［1］。胚胎質量和發育潛能是影響胚胎著床的決定性因素，胚胎染色體異常、透明帶硬化、體外培養環境不當均會導致胚胎著床失敗。本文將全面闡述影響胚胎著床的胚胎因素及研究進展，為從胚胎方面提高著床率提供新思路。

　　1、染色體異常

　　染色體異常是損害胚胎的發育能力、導致著床失敗的主要原因，自發性流產中胚胎非整倍體率高達70%［2］。配子異常和胚胎卵裂異常均可導致染色體異常。Kort等［3］回顧性分析了既往不良妊娠史( 包括復發性流產、非整倍體妊娠、IVF 失敗) 和非醫學原因行性別鑒定IVF患者的植入前遺傳學篩查( preimplan- tation genetic screening，PGS) 結果，非整倍體數在有不良妊娠史患者中高，且非年齡依賴。

　　女性＞35歲后懷孕幾率和胚胎著床率明顯下降， 其主要原因是非整倍體卵子增加，胚胎染色體異常發生率高。Harton 等［2］的一項多中心回顧性分析中，不同年齡組 IVF / ICSI-ET 周期行微陣列比較基因組雜交( comparative genomic hybridization，CGH) ，篩選出整倍體胚胎移植。結果非整倍體率與年齡呈正相關，＜ 35歲發生率為 53. 1%，≥43 歲為 92. 6%。胚胎著床率在＜42 歲的患者中沒有隨年齡改變，≥43 歲的患者則下降。移植整倍體胚胎提高了高齡患者的著床率，這提示胚胎染色體非整倍體性是導致高齡女性著床失敗的重要原因。

　　染色體嵌合體是指在一個個體中同時存在兩種及以上染色體核型的細胞體系，在胚胎發育中很常 見，著床前胚胎發生率為 15% ～ 90%［4］。嵌合體會影響胚胎的發育和著床能力，影響程度與染色體異常發生的時間、數量、位置和后續發育等因素相關。在小鼠的嵌合體胚胎模型中發現嵌合體存在會導致不良結局，但隨著胚胎的發育，非整倍體細胞比例會減少，且有足夠數量正常細胞的嵌合體胚胎能發育為健康胚胎。這說明胚胎在發育過程中有一定的自我選擇和修復能力，嵌合體存在不一定會影響胚胎的最終結局，還需考慮嵌合體數量、發生的位置等。Spinella等［5］在一項前瞻性研究中為 77 例患者移植了嵌合體囊胚，根據嵌合體中非整倍體比例分為低比例嵌合體 (＜50%) 和高比例嵌合體( ＞ 50%) 。研究結果示低比例嵌合體較高比例嵌合體的胚胎種植率、臨床妊娠率 和活產率高( 分別為 48. 9% vs 24. 2%，40. 9% vs15. 2%，42. 2% vs 15. 2%) 。與移植整倍體囊胚患者比較，高比例嵌合體患者的胚胎種植率、臨床妊娠率和活產率均降低( 分別為 24. 4% vs 54. 6%，15. 2% vs46. 4%，15. 2% vs 46. 6%) ，低嵌合體患者則無差異。

　　2 、透明帶因素

　　透明帶在阻止多精受精和維持胚胎完整性方面起重要作用，其異常會影響胚胎的發育，導致著床失敗。暗色透明帶( dark zona pellucida，DZP ) 指在光鏡下折光率低、透光性差、顏色暗，DZP會導致優質胚胎形成率、著床和臨床妊娠率下降。既往認為透明帶厚度( zona pellucida thickness，ZPT) 及透明帶厚度變化 ( zona pellucida thickness variation，ZPTV) 會影響胚胎著床率，但 Lewis 等［6］對 768 例第 3 天新鮮移植胚胎的ZPTV 與胚胎著床之間的關系進行分析，發現 ZPTV 與胚胎著床之間無統計學關聯。胚胎孵出是著床過程中的重要環節，如透明帶硬化則不能孵出，導致著床失敗。輔助孵化( assisited hatching，AH) 包括機械法( 部分透明帶切除) 、化學法、激光法，近年來激光法被廣泛應用于臨床，關于 AH 的作用一直存在爭議。有研究指出AH可以提高ＲIF患者的著床率和臨床妊娠率［7］。但在年齡＜38 歲且 ZPT≥13 μm 婦女中，AH 不能提高胚胎著床率、臨床妊娠率及活產率［8］。最近的一項系統回顧認為［9］，透明帶打薄 AH 對新鮮胚胎移植周期改善臨床結局作用有限，透明帶打孔 AH 可以提高凍融胚胎移植周期的著床率和臨床妊娠率。

　　3 、胚胎培養

　　良好的培養環境與技術是保證胚胎正常發育的基礎，培養環境會直接影響早期胚胎的質量，進而影響胚胎的著床。培養液是與胚胎直接接觸的環境，也是胚胎體外發育唯一的營養來源，其組分、配比、pH值、滲透壓均與胚胎的質量密切相關。現商品化的培養液主要包括序貫培養液和單一培養液。單一培養液有利于囊胚形成，提高囊胚質量，但是對臨床結局兩者無差異［10］。有學者認為胚胎在發育過程中可產生一些促進發育的因子，將胚胎成組培養可以提高囊胚形成率和著床率。Ebner等［11］將 72 例患者 936 原核期胚胎隨機分為 3 組，分別為單獨培養、同一微滴單獨培養和成組培養( 每微滴 3 ～ 5 個) ，均培養至囊胚期。結果成組培養的胚胎有更高的囊胚形成率( 3 組分別為40. 8%、45. 2% 和 55. 8%) ，臨床妊娠率也提高。也有將卵裂期胚胎成組培養至第 3 天，與單獨培養胚胎相比著床率與妊娠率無差別，但在＜ 35 歲婦女中增加可用囊胚數［12］。目前各研究中所使用的培養方案不統一，尚需更多重復試驗證實其作用。

　　在傳統的培養體系中，評估胚胎發育情況需將胚胎從培養箱中取出。多次、長時間的觀察會引起培養液溫度、pH值等參數改變，進而對胚胎發育產生不良影響。Time-lapse實時觀察系統無需移動胚胎就可進行觀察評估，避免了對培養環境的干擾，可提高胚胎質量和著床率。Barrie等［13］ 根據患者年齡、獲卵數、治療方案和取卵時間將使用Time-lapse 培養箱和標準培養箱的患者配對，通過分析比較得到兩組臨床妊娠率、著床率差異有統計學意義 ( 分別為 44. 8% vs 36. 5%，39. 3% vs 32. 2%) 。但近期的其他研究發現［14］，Time-lapse 培養體系沒有提高 IVF / ICSI 新鮮周期著床率。該研究未追蹤在試驗中冷凍的胚胎結局，是否能獲得累計妊娠結局的提高還需進一步探討。

　　4 、胚胎評估

　　篩選出最具發育潛能的胚胎移植是提高 IVF / IC- SI-ET 成功率的關鍵，傳統的胚胎形態學評估仍是目前最常用、最經典的方法。胚胎的形態學特點能反映胚胎質量，可以較好預測胚胎發育潛能。卵裂期評估低質量的胚胎發育為囊胚幾率降低，其發育而成的囊胚著床率也下降40%［15］。囊胚期胚胎評分可以反映其著床和繼續妊娠能力。Irani等［16］ 回顧性分析了417 例凍融整倍體囊胚移植周期，根據冷凍前評分將胚胎分為質量極優、優質、標準和差 4 組，發現極優組和優質組的妊娠率顯著高于差組( 分別為 84. 2%、61. 8%和 35. 8%) ，內細胞團( inner cell mass，ICM) 評分為 A的胚胎妊娠率高于 B 和 C ( 分別為 76. 2%、53. 6% 和13. 5%) 。滋養層細胞( trophectoderm，TE) 評分對預測胚胎發育潛能更重要。TE 評分為 A、B、C 時著床率分別為 67%、51%和 25%，活產率為 57%、40% 和 25%，三者之間差異有統計學意義，且ICM / TE 評分中 BA 著床率優于AB 和BB( 分別為 80%和 52%、44%)［17］。

　　形態學評分不可避免帶有胚胎學家主觀因素，且沒有一個是胚胎質量的絕對標志，在評分為優質的胚胎中非整倍體并不少見。Time-lapse實時觀察系統可以動態連續觀察胚胎的發育情況，觀察到胚胎不正常分裂、碎片出現時間、囊胚形成時間等在傳統評估體系中無法獲得的信息，從而提供更多客觀準確的形態動力學參數，利于全面評估胚胎的發育潛能，篩選出最優的胚胎，提高著床率。目前其對胚胎的評估價值和臨床結局的改善仍有爭議。尋找能夠客觀預測胚胎發育潛能的非侵入性指標對篩選優質胚胎，提高著床率和臨床結局非常重要。

　　5 、胚胎移植選擇策略

　　胚胎移植是 IVF / ICSI-ET 過程中的最后一步，也是影響胚胎著床的關鍵因素。胚胎移植的時期、數目、移植技術、新鮮或者凍胚移植都會關系到著床成功率。在早期受體外培養技術的限制，多選擇 D2 / D3 胚胎移植。隨著培養技術的不斷優化，越來越多人選擇延長培養至 D5 / D6 囊胚移植。囊胚移植更符合人的生理狀態，且延長培養能夠淘汰發育差的胚胎，提高胚胎著床率。相關研究證實囊胚移植可以提高患者的著床率和妊娠率，但近期 Levi-Setti 等［18］ 在＜ 39 歲、至少獲 3 個受精卵和既往少于 4 次 IVF / ICSI-ET 周期史的患者中發現，新鮮周期中囊胚和卵裂期移植著床率和妊娠率無差異。囊胚移植會導致可移植和冷凍胚胎數減少，對于累計活產率的影響還需進一步研究。

　　胚胎冷凍保存技術取得突破，使每取卵周期的成功率和胚胎利用率極大提高。在 ＲIF 患者中整倍體凍胚移植比鮮胚移植成功率高。移植數目增加能提高著床率，但多胎妊娠率增加了高危妊娠發生和孕產婦死亡的概率。我國已規定每個移植周期移植胚胎數不超過 3 個，35 歲以下婦女第 1 次助孕移植胚胎數不超過 2 個。

　　6、其他因素

　　線粒體是為細胞代謝提供能量的重要場所，當胚胎發育異常時其能量代謝會發生改變，線粒體 DNA ( mitochondrial DNA，mtDNA ) 拷貝數會代償性增加。高齡女性、非整倍體和妊娠失敗的胚胎中有較多的mtDNA 拷貝數，且整倍體胚胎 mtDNA 拷貝數超過一定水平時不能著床［19］。mtDNA 拷貝數與胚胎質量和種植潛能相關，測量 mtDNA 拷貝數可作為評估胚胎發育潛能的指標。Victor 等［20］則在研究中指出，mtDNA拷貝數與胚胎整倍體性、年齡、著床能力不相關，其對胚胎發育潛能的預測價值有待商榷。

　　此外，胚胎在培養過程中產生的一些物質與發育潛能和著床力相關，培養液中檢測胚胎基質金屬蛋白酶( MMP-9) 、白細胞介素 8( IL-8) 可用于預測著床率和妊娠率。緊縮現象指在囊胚形成期間，卵周間隙因滋養層細胞退縮再次出現。有研究發現［21］，緊縮現象的發生在非整倍體胚胎中高于整倍體，且會損害整倍體胚胎的著床能力。

　　7、結 語

　　輔助生殖技術的不斷進步幫助眾多不孕不育夫婦實現了為人父母的愿望，但胚胎著床失敗仍是解決不孕癥的難題。現胚胎體外培養技術日趨完善，冷凍技術提高了胚胎利用率，篩選出最具發育潛能的胚胎移植是提高著床率的關鍵。植入前遺傳學檢測能夠篩選出染色體異常，Time-lapse實時監測系統能夠提供胚胎發育過程中客觀的形態動力學指標。如將兩者結合起來用于胚胎篩選，既能知道染色體是否正常，又能從形態學上更加客觀全面評估，利于篩選出最具發育潛能的胚胎，提高著床率。因價格昂貴和缺乏足夠證據，目前沒有廣泛使用，其應用是否利于妊娠結局還存在眾多爭議，需要進一步探討。除此之外，多種動力學、代謝參數也被提出用于評價胚胎質量，其預測價值仍尚需更多研究明確。提高胚胎質量和尋找客觀無創的胚胎發育潛能預測指標，是提高胚胎著床率仍需不斷探索的問題。

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